玉米酵母双杂交cDNA文库的构建及ZmCEN互作蛋白的筛选

为阐明玉米中心蛋白（ZmCEN）的生物学功能，采用酵母双杂交技术对其互作蛋白进行研究。

提取玉米（Zea mays L.）自交系‘郑58’幼苗的总RNA，利用SMART技术反转录合成ds cDNA，构建以pGBKT7为载体的酵母双杂交cDNA文库； 依据ZmCEN基因的CDS序列设计引物，构建重组诱饵载体（pGBKT7-ZmCEN）转化酵母菌株Y2HGold，检测诱饵载体的毒性与自激活能力后，筛选与玉米中心蛋白（ZmCEN）互作的猎物蛋白。

将筛选的互作蛋白NAC67和TONNEAU1b（TON1b）再次验证相互作用，并选取互作蛋白TON1b，采用BiFC实验分别构建ZmCEN-pSPYNE和TON1b-pSPYCE BiFC半分子重组载体，转化拟南芥原生质体，进一步验证它们在细胞内的互作； 并利用Uniprot和KEGG在线网站对互作蛋白进行gene ontology（GO）注释分析。

结果表明：玉米全株幼苗的cDNA文库库容量达到2.56×10^7 CFU，文库滴度5.36×10^8 CFU/mL，符合建库要求。经检测诱饵载体无毒性也无自激活功能，所筛选的cDNA文库经测序和Blast比对分析以及共转验证，最终得到28个与诱饵蛋白ZmCEN互作的蛋白质。

GO注释显示互作蛋白参与的生物过程有21种。

BiFC结果显示，蛋白TON1b与ZmCEN在拟南芥原生质体细胞内互作而形成互补，从而产生黄色荧光，进一步证实了两者存在互作关系。

为阐明玉米中心蛋白（ZmCEN）的生物学功能，采用酵母双杂交技术对其互作蛋白进行研究。

提取玉米（Zea mays L.）自交系‘郑58’幼苗的总RNA，利用SMART技术反转录合成ds cDNA，构建以pGBKT7为载体的酵母双杂交cDNA文库;

依据ZmCEN基因的CDS序列设计引物，构建重组诱饵载体（pGBKT7-ZmCEN）转化酵母菌株Y2HGold，检测诱饵载体的毒性与自激活能力后，筛选与玉米中心蛋白（ZmCEN）互作的猎物蛋白。

将筛选的互作蛋白NAC67和TONNEAU1b（TON1b）再次验证相互作用，并选取互作蛋白TON1b，采用BiFC实验分别构建ZmCEN-pSPYNE和TON1b-pSPYCE BiFC半分子重组载体，转化拟南芥原生质体，进一步验证它们在细胞内的互作;

并利用Uniprot和KEGG在线网站对互作蛋白进行gene ontology（GO）注释分析。

结果表明:玉米全株幼苗的cDNA文库库容量达到2.56×107 CFU，文库滴度5.36×108 CFU/mL，符合建库要求。

经检测诱饵载体无毒性也无自激活功能，所筛选的cDNA文库经测序和Blast比对分析以及共转验证，最终得到28个与诱饵蛋白ZmCEN互作的蛋白质。

GO注释显示互作蛋白参与的生物过程有21种。

BiFC结果显示，蛋白TON1b与ZmCEN在拟南芥原生质体细胞内互作而形成互补，从而产生黄色荧光，进一步证实了两者存在互作关系。