人畜共患羊种布鲁杆菌感染牦牛及其细胞免疫抗原的筛选

1. 本项目期间，邀请了合作单位美国西北大学费因伯格医学院微生物与免疫系Diane Ordway教授来我校进行科研合作与交流。教授赴青海省循化县白庄镇“规模化养殖小区”和岗察乡“家庭牧场”进行了实地考察。就养殖小区的规划设计、牛羊的产地检疫、布鲁菌人畜间感染的条件及布鲁菌的“净化”、人体感染布鲁菌病的症状对养殖户做了讲解和交流，并提出了宝贵的防治建议，深受养殖户欢迎。同时，在青海大学农牧学院为本专业领域内的科研人员、教师和研究生做了两场学术报告。报告主题分别为《流式细胞术及其在结核分枝杆菌中的应用》和《细胞内细菌（如结核分枝杆菌）的免疫学特征及新型疫苗研究方向》。期间，与专业相关老师进行了学术交流，就今后的合作方向及内容等达成了合作意向，为今后进一步加强两单位的科研合作奠定了基础。

2. 2014年5月，参加了在长春市举办的第四届全国人畜共患病学术研讨会。2015年11月7日至10日，于福州参加了2015中国兽医大会。

3. 本实验结果表明，从牛体内未发现羊种布鲁菌，却在绵羊中发现羊种3型布鲁菌。

4. 应用固相pH梯度双向凝胶电泳对布鲁菌羊种3型毒株和疫苗株M5的菌体全蛋白质进行分离，利用ImageMaster 2D Platinum软件及质谱鉴定，获得布鲁菌羊种3型毒株的蛋白点792±22个，疫苗株M5蛋白点831±29个，两者匹配上的蛋白点共有580个，匹配率为71.25%。从中共筛选出53个差异蛋白点进行质谱鉴定，其中49个蛋白点在数据库中匹配到了有意义的蛋白质，共代表了35个不同的开放式阅读框（ORFs）。在这49个蛋白点中，布鲁菌疫苗株M5高表达的蛋白22个，布鲁菌羊种3型毒株高表达的27个。得到的49个差异蛋白功能涉及糖的代谢、脂的代谢、蛋白的合成以及外膜蛋白、分子伴侣等众多事件。其中，Dps蛋白、外膜蛋白Omp25、糖结合蛋白在布鲁菌羊种3型毒株中的高表达可能与布鲁菌的毒力有关；侵袭蛋白B在布鲁菌羊种3型毒株与疫苗株M5中均有大量的表达，很可能与布鲁菌致病性有关。布鲁菌疫苗株M5中高表达的外膜蛋白Omp31前体可能与良好的免疫原性有关。

5. 设计引物，以羊种布鲁氏杆菌3型青海省海晏县分离株为研究对象，从其基因组中扩增出Omp22、Omp15、Omp2b、Omp31基因。通过T4 DNA连接酶成功的将扩增基因片段克隆到pMD19-T载体上。利用生物信息学软件对测序结果进行分析，结果表明青海羊3型布鲁氏杆菌与已知羊种布鲁氏杆菌Omp22、Omp15、Omp2b、Omp31的同源性分别达到99.84%、96.72%、100%和100%，其中Omp22的第461个碱基G突变为C；Omp15的7处突变，表现为6处AA碱基的增添和第388个碱基C突变为T；另对羊种布鲁氏杆菌3型的Omp22、Omp15、Omp2b和Omp31分子中可能成为其抗原决定簇的区段进行预测，结果为Omp22分子的28aa～40aa和109aa～121aa、Omp15分子的42aa～49aa和77aa～83aa、Omp2b分子的178aa～190aa和251aa～262aa、Omp31分子的7aa～16aa和102aa～111aa区段成为其蛋白分子抗原决定簇的可能性很大。

用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ、BamHⅠ和EcoRⅠ、XhoⅠ和NdeⅠ分别酶切相应蛋白的重组克隆质粒和原核表达载体pGEX-4T-1、pET28b（+），经连接、转化后成功构建了外膜蛋白Omp22、Omp2b、Omp31和Omp15重组表达质粒，经测序有正确读码框。经IPTG诱导表达，Omp22、Omp15和Omp31的表达融合蛋白分子量分别约为48kDa、41kDa、28kDa，Omp2b诱导表达效果不好。用兔/豚鼠的布鲁氏杆菌阳性血清为一抗，HRP标记的山羊抗兔/豚鼠IgG为二抗，进行Western-blot检测，证明了Omp22、Omp15和Omp31蛋白的反应原性。

此研究为大量制备重组蛋白及其免疫原性及相关功能研究奠定基础，也为布鲁氏杆菌病的诊断、用药及疫苗研究提供线索。

6. 获得了Omp31蛋白在COS-7细胞中得到了高表达，为后续的研究奠定了基础。

7. 小鼠淋巴细胞增殖试验发现，小鼠被注入pcDNA3.1（+）-Omp31重组蛋白后，小鼠脾脏淋巴细胞对ConA诱导的增殖反应增强，这一结果为布鲁菌新型疫苗的进一步研制提供了理论依据。

1、本项目期间邀请了合作单位美国西北大学费因伯格医学院微生物与免疫系Diane Ordway教授来我校进行科研合作与交流,并赴青海省循化县白庄镇“规模化养殖小区”、岗察乡“家庭牧场”进行了实地考察,就养殖小区的规划设计、牛羊的产地检疫、布鲁菌人畜间感染的条件及布鲁菌的“净化”、人体感染布鲁菌病的症状对养殖户做了讲解和交流,对这些病的防治时间和措施提出了宝贵的建议,深受养殖户的欢迎。并在青海大学农牧学院为本专业领域内的科研人员、教师和研究生做了二场学术报告(1、Flow cytometryand it‘s application in mycobacterium tuberculosis;2、The immunological characteristic and new vaccine research orientation of intracellular bacteria （for example mycobacterium tuberculosis）,期间和专业相关老师进行了学术交流,就今后的合作方向及内容等达成了合作意向,为今后进一步加强两单位的科研合作奠定了基础。2、2014 年 5 月参加了在长春市举办的第四届全国人畜共患病学术研讨会,2015年11月7日至10日,于福州参加了2015中国兽医大会。3、本实验结果表明从牛体内未发现羊种布鲁菌,却在绵羊中发现羊种3型布鲁菌。4、应用固相pH梯度双向凝胶电泳对布鲁菌羊种3型毒株和疫苗株M5的菌体全蛋白质进行分离,利用ImageMaster 2D Platinum软件及质谱鉴定, 获得布鲁菌羊种3型毒株的蛋白点792±22个,疫苗株M5蛋白点831±29个,两者匹配上的蛋白点共有580个,匹配率为71.25%。从中共筛选出53个差异蛋白点进行质谱鉴定,其中49个蛋白点在数据库中匹配到了有意义的蛋白质,共代表了35个不同的开放式阅读框（ORFs）。在这49个蛋白点中,布鲁菌疫苗株M5高表达的蛋白22个,布鲁菌羊种3型毒株高表达的27个。得到的49个差异蛋白功能涉及糖的代谢、脂的代谢、蛋白的合成以及外膜蛋白、分子伴侣等众多事件,其中,Dps蛋白、外膜蛋白Omp25、糖结合蛋白在布鲁菌羊种3型毒株中的高表达可能与布鲁菌的毒力有关;侵袭蛋白B在布鲁菌羊种3型毒株与疫苗株M5中均有大量的表达,很可能与布鲁菌致病性有关。布鲁菌疫苗株M5中高表达的外膜蛋白Omp31前体可能与良好的免疫原性有关。5、羊种布鲁氏杆菌外膜蛋白Omp22、Omp15、Omp2b和Omp31的核苷酸序列设计引物,以羊种布鲁氏杆菌3型青海省海晏县分离株为研究对象,从其基因组中扩增出Omp22、Omp15、Omp2b、Omp31基因。通过T4 DNA连接酶成功的将扩增基因片段克隆到pMD19-T载体上。利用生物信息学软件对测序结果进行分析,结果表明青海羊3型布鲁氏杆菌与已知羊种布鲁氏杆菌Omp22、Omp15、Omp2b、Omp31的同源性分别达到99.84%、96.72%、100%和100%,其中Omp22的第461个碱基G突变为C;Omp15的7处突变,表现为6处AA碱基的增添和第388个碱基C突变为T;另对羊种布鲁氏杆菌3型的Omp22、Omp15、Omp2b和Omp31分子中可能成为其抗原决定簇的区段进行预测,结果为Omp22分子的28aa～40aa和109aa～121aa、Omp15分子的42aa～49aa和77aa～83aa、Omp2b分子的178aa～190aa和251aa～262aa、Omp31分子的7aa～16aa和102aa～111aa区段成为其蛋白分子抗原决定簇的可能性很大。用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ、BamHⅠ和EcoRⅠ、XhoⅠ和NdeⅠ分别酶切相应蛋白的重组克隆质粒和原核表达载体pGEX-4T-1、pET28b（+）,经连接、转化后成功构建了外膜蛋白Omp22、Omp2b、Omp31和Omp15重组表达质粒,经测序有正确读码框。经IPTG诱导表达,Omp22、Omp15和Omp31的表达融合蛋白分子量分别约为48kDa、41kDa、28kDa,Omp2b诱导表达效果不好。用兔/豚鼠的布鲁氏杆菌阳性血清为一抗,HRP标记的山羊抗兔/豚鼠IgG为二抗,进行Western-blot检测,证明了Omp22、Omp15和Omp31蛋白的反应原性。此研究为大量制备重组蛋白及其免疫原性及相关功能研究奠定基础,也为布鲁氏杆菌病的诊断、用药及疫苗研究提供线索。6、获得了Omp31蛋白在COS-7细胞中得到了高表达,为后续的研究奠定了基础。7、小鼠淋巴细胞增殖试验发现,小鼠被注入pcDNA3.1（+） -Omp31重组蛋白后,小鼠脾脏淋巴细胞对ConA诱导的增殖反应增强,这一结果为布鲁菌新型疫苗的进一步研制提供了理论依据。