具有内毒素吸附能力的耶氏酵母和内毒素减毒大肠杆菌

1. 成果简介 研发有效的内毒素LPS脱毒方法具有重要意义。本项目通过KDO定量方法检测对LPS分子的吸附能力，从发酵食品中筛选到LPS吸附能力最强的酵母菌株CSW。证实LPS与Y. lipolytica细胞共存一段时间后，会产生LPS含量降低的现象。通过18s rDNA分析，菌株CSW1与1.0 mg/mL来源于E. coil O111：B4的LPS共存后，可使LPS水平降低约70%，而S. cerevisiae BY4742仅使LPS含量近30%。另外，过敲除大肠杆菌E. coli染色体基因上与LPS合成相关基因，构建了多株能够直接合成新型特殊结构Kdo2-lipid A的突变菌株，具有低内毒素，适合用于大肠杆菌表达宿主生产各种蛋白及氨基酸。

2. 关键技术 脂多糖LPS是存在于大多数革兰氏阴性菌外膜的主要组成部分，可通过激活宿主细胞内TLR4受体信号转导途径等，促进炎性细胞分泌多种细胞因子，进而引发强烈的免疫反应，造成疾病或死亡，在食品和药品中是重要的毒力因子。因此，研发有效的LPS脱毒方法具有重要意义。本成果获得了食品级的LPS脱毒菌株，具有应用前景。工业发酵中大肠杆菌野生型菌株的内毒素释放是导致热原污染的重要原因，这增加了分离纯化成本。本成果从源头改造获得低毒性的大肠杆菌平台菌株，避免了发酵工程中热原产生。

3. 知识产权

   • 一株具有内毒素吸附特性的耶氏酵母及其吸附特性研究方法，专利号：201410713700.5
   • 一种低毒含五条脂肪酸链的Kdo2-单磷酸类脂A的制备与应用，专利号：201510282822.8

4. 项目成熟度 本成果对酵母菌株脱毒进行了系统验证，采用荧光示踪法分析了酵母菌株对LPS的吸附特性。通过不同LPS孵育浓度下的观察结果均表明，Y. lipolytica细胞表面呈现出明显的LPS附着现象，结合LPS定量结果，可以推测解脂耶氏酵母反应体系中LPS含量明显降低（~70%）与其细胞表面的LPS吸附特性有关。最后分析了酵母对LPS脱毒机制，因此本成果具有重要理论基础。通过基因工程改造获得五株E. coli突变菌株，所合成的LPS缺失了多糖长链，变为结构特殊的Kdo2-lipid A结构。通过用活菌体直接刺激HEK-Blue hTLR4细胞，发现五株突变菌株的细胞激起TLR4信号通路的活性比野生型W3110均有所下降；细胞毒性大幅降低。

5. 投资期望及应用情况 LPS又称内毒素，是存在于革兰氏阴性菌细胞壁外膜表面的一种大分子物质，一般只有在细胞死亡或分解时自行释放到周围介质中，特殊条件下也可以从活细胞中直接泄漏出来。因此，如何脱除LPS具有重要应用前景，将为食品和制药行业热原去除提供新的解决方法。本成果中的食品级酵母菌株，具有重要推广价值，减毒的大肠杆菌菌株也是工业发酵的良好宿主和底盘细胞。

1成果简介

研发有效的内毒素LPS脱毒方法具有重要意义，本项目一方面通过KDO定量方法检测对LPS分子的吸附能力，从发酵食品中筛选到LPS吸附能力最强酵母菌株CSW。证实LPS与Y。 lipolytica细胞共存一段时间后，会产生LPS含量降低的现象。通过18s r DNA分析，菌株CSW1与1。0 mg/m L来源于E。 coil O111：B4的LPS共存后，可使LPS水平降低约70%，而S。 cerevisiae BY4742仅使 LPS含量近30%。

另外一方面，过敲除大肠杆菌E。 coli染色体基因上与LPS合成相关基因，构建了多株能够直接合成新型特殊结构Kdo2-lipid A的突变菌株，具有低内毒素，适合用于大肠杆菌表达宿主生产各种蛋白及氨基酸。

2关键技术

脂多糖LPS是存在于大多数革兰氏阴性菌外膜的主要组成部分，可通过激活宿主细胞内TLR4受体信号转导途径等，促进炎性细胞分泌多种细胞因子，进而引发强烈的免疫反应，造成疾病或者死亡，在食品和药品中是重要的毒力因子，因此研发有效的LPS脱毒方法具有重要意义。本成果获得了食品级的LPS脱毒菌株，具有应用前景。

工业发酵中大肠杆菌野生型菌株中内毒素释放，是导致热原污染的重要原因，这增加了分离纯化成本，本成果从源头改造获得低毒性的大肠杆菌平台菌株，避免了发酵工程中热原产生。

3知识产权

一株具有内毒素吸附特性的耶氏酵母及其吸附特性研究方法201410713700。5

？一种低毒含五条脂肪酸链的Kdo2-单磷酸类脂A的制备与应用201510282822。8

4项目成熟度；

本成果对酵母菌株脱毒进行了系统验证，采用荧光示踪法分析了酵母菌株对 LPS 的吸附特性。通过不同LPS孵育浓度下的观察结果均表明，Y。 lipolytica细胞表面呈现出明显的LPS附着现象，结合LPS定量结果，可以推测解脂耶氏酵母反应体系中LPS含量明显降低（~70%）与其细胞表面的LPS吸附特性有关；最后分析了酵母对LPS脱毒机制，因此本成果具有重要理论基础。

通过基因工程改造获得五株E。 coli突变菌株，所合成的LPS缺失了多糖长链，变为结构特殊的Kdo2-lipid A结构，通过用活菌体直接刺激HEK-Blue hTLR4细胞，发现五株突变菌株的细胞激起TLR4信号通路的活性比野生型W3110均有所下降；细胞毒性大幅降低。

5投资期望及应用情况

LPS又称内毒素，是存在于革兰氏阴性菌细胞壁外膜表面的一种大分子物质，一般只有在细胞死亡或分解时自行释放到周围介质中，特殊条件下也可以从活细胞中直接泄漏出来。因此如何脱除LPS具有重要应用前景，将为食品和制药行业热原去除提供新的解决方法。本成果中的食品级酵母菌株，具有重要推广价值，减毒的大肠杆菌菌株也是工业发酵的良好宿主和底盘细胞。