舍饲肉羊疫病动态防控关键技术研究--绵羊肺腺瘤病毒单克隆抗体的研制与酶联免疫检测技术的研究与开发

近年来，绵羊肺腺瘤病已严重威胁我国种羊的生产和养羊业的发展，同时影响羊肉的食品安全。针对目前对于绵羊肺腺瘤病的诊断在世界范围内尚无统一的检测技术标准，立项了“舍饲肉羊疫病动态防控关键技术研究——绵羊肺腺瘤病毒单克隆抗体的研制与酶联免疫检测技术的研究与开发”项目。

该项目应用现代分子生物学和分子免疫学技术，制备特异性强的单克隆抗体和多克隆抗体，建立一套敏感特异的酶联免疫检测技术的检测方法。该方法的建立对控制羊呼吸道传染病的发生，促进我区养羊业的健康发展具有重要意义。

该项目的主要完成了以下研究内容：

1. 成功构建了绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白原核表达质粒和制备了多克隆抗体，pET32a-env与pEG-4T-3-env，pET32a-su与pEG-4T-3-su，可表达带有组氨酸（His）和谷胱甘肽（GST）标签的绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白（ENV）和绵羊肺腺瘤病毒表面蛋白（SU）的重组融合蛋白。成功的纯化出大量ENV-GST，SU-His重组融合蛋白，并且纯度能够满足制备多克隆抗体的需要。制备的兔抗绵羊肺腺瘤病毒表面蛋白多克隆抗体可用于免疫组化与western-blot检测试验的需要。试验证明制备的绵羊肺腺瘤病毒表面蛋白多克隆抗体可识别绵羊肺腺瘤病毒的天然病毒粒子。

2. 成功制备绵羊肺腺瘤病毒跨膜蛋白CT单克隆抗体，通过生物信息学分析的结果合成抗原性较好的一段由44个氨基酸组成的多肽，用于制备绵羊肺腺瘤病毒跨膜蛋白单克隆抗体。该多肽的44个氨基酸位于跨膜蛋白胞质尾区（CT），因此称为CT单抗。CT单抗经过自然感染绵羊肺腺瘤病的免疫组化与western-blot检测证明了CT单克隆抗体可识别绵羊肺腺瘤病毒的天然病毒粒子。

3. 成功建立了双抗体夹心ELISA检测方法。该方法对羊常见疫病（羊布鲁菌病、羊快疫、羔羊痢疾、羊肠毒血症、羊猝狙、羊痘、小反刍兽疫、亚Ⅰ型、O型、A型口蹄疫）的疫苗、羊肺炎支原体、ENTV的表面蛋白以及enJSRV囊膜蛋白的检测结果均为阴性；对JSRV病肺组织提取蛋白的最低检出浓度为0.034 mg/mL；该方法的批间复性在3.112%～6.801%之间，批内重复性1.380%～4.763%之间；包被板在37℃存放7 d，阳性样品ELISA检测结果仍为阳性，包被板37℃存放0 d与1、2、3 d阳性样品ELISA检测结果差异不显著（P＞0.05）。实验证明建立的JSRV囊膜蛋白双抗体夹心ELISA检测方法特异性、灵敏性、重复性、稳定性较好，可用于OPA的活体临床检测。

完成本项目共发表学术论文7篇，其中3篇SCI收录，4篇中文核心期刊，申请专利1项，培养1名博士和3名硕士。1项国家标准“绵羊肺腺瘤病毒核酸斑点杂交检测技术”；1项地方检测标准绵羊肺腺瘤病毒双抗体夹心ELISA检测技术。

近年来绵羊肺腺瘤病已严重威胁我国种羊的生产和养羊业的发展,同时影响羊肉的食品安全。舍饲肉羊疫病动态防控关键技术研究-绵羊肺腺瘤病毒单克隆抗体的研制与酶联免疫检测技术的研究与开发项目是针对目前对于绵羊肺腺瘤病的诊断在世界范围内尚无统一的检测技术标准而立项的。该项目应用现代分子生物学和分子免疫学技术制备特异性强的单克隆抗体和多克隆抗体,建立一套敏感特异的酶联免疫检测技术的检测方法。该方法的建立对控制羊呼吸道传染病的发生,促进我区养羊业的健康发展具有重要意义。该项目的主要完成了以下研究内容：（1）成功构建了绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白原核表达质粒和制备了多克隆抗体,pET32a-env与pEG-4T-3-env,pET32a-su与 pEG-4T-3-su,可表达带有组氨酸（His）和谷胱甘肽（GST）标签的绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白（ENV）和绵羊肺腺瘤病毒表面蛋白（SU） 的重组融合蛋白。成功的纯化出大量ENV-GST,SU-His重组融合蛋白,并且纯度能够满足制备多克隆抗体的需要,制备的兔抗绵羊肺腺瘤病毒表面蛋白多克隆抗体可用于免疫组化与western-blot检测试验的需要,试验证明制备的绵羊肺腺瘤病毒表面蛋白多克隆抗体可识别绵羊肺腺瘤病毒的天然病毒粒子。（2）成功制备绵羊肺腺瘤病毒跨膜蛋白CT单克隆抗体,通过生物信息学分析的结果合成抗原性较好的一段由44个氨基酸组成的多肽,用于制备绵羊肺腺瘤病毒跨膜蛋白单克隆抗体,该多肽的44个氨基酸位于跨膜蛋白胞质尾区（CT）,因此称为CT单抗。CT单抗经过自然感染绵羊肺腺瘤病的免疫组化与western-blot检测证明了CT单克隆抗体可识别绵羊肺腺瘤病毒的天然病毒粒子。（3）成功建立了双抗体夹心ELISA检测方法。该方法对羊常见疫病（羊布鲁菌病,羊快疫,羔羊痢疾,羊肠毒血症,羊猝狙,羊痘,小反刍兽疫,亚Ⅰ型、O型、A型口蹄疫）的疫苗,羊肺炎支原体,ENTV的表面蛋白以及enJSRV囊膜蛋白的检测结果均为阴性;对JSRV病肺组织提取蛋白的最低检出浓度为0.034 mg/mL;该方法的批间复性在3.112%～6.801%之间,批内重复性1.380%～4.763%之间;包被板在37℃存放7 d,阳性样品ELISA检测结果仍为阳性,包被板37 ℃存放0 d与1、2、3 d阳性样品ELISA检测结果差异不显著（P＞0.05）。实验证明建立的JSRV囊膜蛋白双抗体夹心ELISA检测方法特异性、灵敏性、重复性、稳定性较好,可用于OPA的活体临床检测。完成本项目共发表学术论文7篇,其中3篇SCI收录,4篇中文核心期刊,申请专利1项,培养1名博士和3名硕士。1项国家标准“绵羊肺腺瘤病毒核酸斑点杂交检测技术”;1项地方检测标准绵羊肺腺瘤病毒双抗体夹心ELISA检测技术。