基于4-羟基苯乙酸-3-羟化酶突变体的基因工程大肠杆菌发酵生产左旋多巴

帕金森病是一种在老年人群中常见的慢性、进行性、运动障碍性中枢神经系统疾病。帕金森病主要是由于大脑中缺乏多巴胺引起的。左旋多巴（Levodopa，L-dopa）为目前治疗帕金森病的主要药物。

多巴胺不能通过血脑屏障到达大脑，治疗帕金森病。而L-dopa能够通过血脑屏障，到达中枢神经系统，并在体内脱羧酶的作用下转变为多巴胺，从而治疗帕金森病。常见的治疗帕金森病的药物多为L-dopa及其与其他药物的复合物，如美多芭、息宁等。

在全球500强畅销药物市场中，抗帕金森治疗市场超过20亿美元。来源于大肠杆菌的4-羟基苯乙酸-3-羟化酶（p-hydroxyphenylacetate 3-hydroxylase，PHAH）具有较宽的底物范围，可以将L-酪氨酸转化为L-dopa，反应单向进行，产物均为L型，且该酶不会进一步氧化L-dopa。但由于L-酪氨酸并不是PHAH的最适底物，该方法催化生成L-dopa反应速率慢，到目前文献报道的最高产率为12.5g/L，并不能实际生产应用。

前期本实验室通过对大肠杆菌芳香族氨基酸代谢途径进行改造，已获得从葡萄糖发酵生成L-酪氨酸高产大肠杆菌菌株，发酵水平仅次于美国麻省理工学院与美国杜邦合作文献报道的L-酪氨酸发酵水平。

本课题对4-羟基苯乙酸-3-羟化酶进行突变改造，获得了一催化反应速度大幅提升的突变体。在L-酪氨酸的代谢途径的基础上，含4-羟基苯乙酸-3-羟化酶突变体的大肠杆菌培养38小时转化生成左旋多巴产率即可达50g/L以上，且培养发酵简单易行，为世界上首个采用此法可实现大规模工业应用的左旋多巴生产路线。

目前左旋多巴市场价格约为50万/吨，此法生产成本远低于左旋多巴市场价格。

成熟程度及推广应用情况：小试工艺完成投资估算和经济效益分析：100吨发酵规模即可年产200吨左旋多巴原料药，年产值可过亿，生产成本远低于左旋多巴市场价格，经济效益显著。

成果亮点： 1. 具有完全自主知识产权； 2. 世界上首个采用此法可大规模应用的左旋多巴生产路线，工艺简单易行； 3. 环境友好，整个过程无有机溶剂。

帕金森病是一种是老年人群中常见的慢性、进行性、运动障碍性中枢神经系统疾病。帕金森病主要是由于大脑中缺乏多巴胺引起的.左旋多巴(Levodopa,L-dopa)为目前治疗帕金森病的主要药物.多巴胺不能够通过血脑屏障到达大脑治疗帕金森病，而L-dopa能够通过血脑屏障，到达中枢神经系统，并在体内脱羧酶的作用下转变为多巴胺，从而治疗帕金森病.常见的治疗帕金森病的药物多为L-dopa及其与其他药物的复合物，如美多芭、息宁等。在全球500强畅销药物市场中，抗帕金森治疗市场超过20亿美元。

来源于大肠杆菌的4-羟基苯乙酸-3-羟化酶(p-hydroxyphenylacetate3-hydroxylase，PHAH)具有较宽的底物范围，可以将L-酪氨酸转化为L-dopa，反应单向进行，产物均为L型，且该酶不会进一步氧化L-dopa。但由于L-酪氨酸并不是PHAH的最适底物，该方法催化生成L-dopa反应速率慢，到目前文献报道的最高产率为12.5g/L，并不能实际生产应用。

前期本实验室通过对大肠杆菌芳香族氨基酸代谢途径进行改造，已获得从葡萄糖发酵生成L-酪氨酸高产大肠杆菌菌株，发酵水平仅次于美国麻省理工学院与美国杜邦合作文献报道的L-酪氨酸发酵水平.本课题对4-羟基苯乙酸-3-羟化酶进行突变改造，获得了一催化反应速度大幅提升的突变体。在L-酪氨酸的代谢途径的基础上，含4-羟基苯乙酸-3-羟化酶突变体的大肠杆菌培养38小时转化生成左旋多巴产率即可达50g/L以上，且培养发酵简单易行为世界上首个采用此法可实现大规模工业应用的左旋多巴生产路线。目前左旋多巴市场价格约为50万/吨，此法生产成本远低于左旋多巴市场价格。

成熟程度及推广应用情况：

小试工艺完成

投资估算和经济效益分析：

100吨发酵规模即可年产200吨左旋多巴原料药，年产值可过亿，生产成本远低于左旋多巴市场价格，经济效益显著。

成果亮点：

1、具有完全自主知识产权；

2、世界上首个采用此法可大规模应用的左旋多巴生产路线，工艺简单易行。

3、环境友好，整个过程无有机溶剂