治疗性幽门螺旋杆菌多表位疫苗的生物信息学设计及其免疫学效果评价

幽门螺旋杆菌（Hp）是慢性胃炎、消化性胃溃疡和胃癌等疾病的重要致病因子。

幽门螺旋杆菌感染呈世界性分布，在发达国家，Hp感染率为30%～50%。在我国，Hp感染率更加严峻，高达58.07%，且呈现明显的家庭聚集性。

多联抗生素疗法治疗幽门螺旋杆菌（Hp）感染性胃病面临着Hp耐药性、副作用和治疗后再感染等问题，因此研制治疗性Hp疫苗是一项重要而紧迫的课题。

本项目依据机体对Hp的免疫保护性机制和表位疫苗的构建理论，合理选择Hp多种关键毒力因子和黏附因子（如UreA、UreB、HpaA、CagA、CagL、KatA、NAP、Lpp20、HSP60）的B和Th优势抗原表位。利用多表位疫苗的设计理论和生物信息学软件，对抗原表位肽连接顺序、间隔序列和表位拷贝数以及分子内佐剂CTB或NAP的偶联顺序进行分析和确定，构建了多种具有科学合理结构、可激发针对Hp关键黏附因子和毒力因子的、高特异性的抗体体液免疫应答和混合型细胞免疫应答的治疗性多表位疫苗（如CTB-UE、CWAE、CFAdE、FVpE）。

对上述治疗性多表位疫苗的研究实验结果如下：

1. 通过生物信息学软件MOE、DNAstar和RANKPEP等分析，所设计治疗性多表位疫苗均具有较好的等电点、抗原性和高级结构。

2. 利用基因合成、双酶切和PCR等分子克隆技术构建相应的重组表达载体，并将其转入BL21（DE3）或Arctic Express大肠杆菌中。经IPTG诱导可获得较高表达的目的蛋白。采用Ni-NTA亲和层析和DEAE Sepharose FF阴离子交换层析获得了较高纯度的目的蛋白CTB-UE、CWAE、CFAdE和FVpE，纯度分别为96.8%、96.8%、95.2%、97.1%。

3. 利用Hp多表位疫苗免疫BALB/c小鼠，采用Western blot、ELISA、Hp尿素酶活性抑制等实验证明：CTB-UE具有较好的免疫原性和免疫特异性，能够激发可识别Hp尿素酶A、B双亚基的高滴度表位特异性抗体和细胞免疫应答，且能有效抑制Hp尿素酶活性。

4. 分子内佐剂CTB组分能够形成五聚体结构且与神经节苷脂GM1特异性结合，具有较好的免疫佐剂活性。CWAE可激发机体产生针对Hp尿素酶A/B双亚基、黏附素HpaA、热休克蛋白HSP60和中性粒细胞激活蛋白NAP的高滴度表位特异性抗体和细胞免疫应答。

5. CFAdE能够激发BALB/c小鼠产生针对Hp尿素酶A/B双亚基、三种外膜蛋白（Lpp20、HpaA、CagL）的T细胞免疫应答和高滴度特异性抗体。FVpE能够激发BALB/c小鼠产生针对Hp尿素酶A/B双亚基、CagA、VacA和NAP的T细胞免疫应答和高滴度特异性抗体。

6. 通过构建Hp感染BALB/c小鼠或蒙古沙鼠模型，利用快速Hp尿素酶实验、组织病理性切片和Hp定量培养等多种实验方法证实：CTB-UE和CWAE能够显著降低小鼠胃部Hp尿素酶活性，减少定植于小鼠胃部的Hp，减轻小鼠胃部炎症，具有较为显著的治疗Hp感染效果。

7. 利用流式细胞术、淋巴细胞增值实验和ELISA等实验表明：Hp关键抗原或所选择的Th细胞表位等刺激物能够特异性诱导CTB-UE或CWAE免疫小鼠的脾脏淋巴细胞发生增殖，流式细胞术表明CD4+ T细胞明显增殖。CTB-UE、CWAE能够激发机体产生高滴度IgG、IgA和黏膜分泌性IgA抗体（sIgA）以及IL-4、IFN-γ、IL-17等细胞因子。

本项目设计的Hp多表位疫苗，结构全新，其主要由Hp多种关键毒力因子和黏附因子的B和Th优势抗原表位多拷贝体构成。创新性体现在以下3点：

1. 选择“可激发中和抗体的B细胞抗原表位和优势Th细胞抗原表位”来代替具有生物毒性的天然Hp大抗原，可避免Hp天然抗原的生物学毒性。

2. 采取“偶联分子内免疫佐剂”和“抗原表位多重拷贝”两种设计思路来增强Hp关键毒力因子和黏附因子抗原表位肽的免疫原性，解决表位疫苗免疫原性普遍较低的缺陷。

3. 将Hp关键毒力因子和黏附因子二者结合起来，选择其优势Th和B细胞抗原表位，激发特异性细胞免疫应答和抗体体液免疫应答，以达到有效防治Hp感染性疾病的目的。

本项目针对治疗性Hp多表位疫苗的研究，有助于我国获得具有自主知识产权的治疗性Hp疫苗，社会经济效益前景可观。

幽门螺旋杆菌（Hp）是慢性胃炎、消化性胃溃疡和胃癌等疾病的重要致病因子。

幽门螺旋杆菌感染呈世界性分布，在发达国家，Hp感染率为30%～50%，在我国Hp感染率更加严峻，高达58.07%，且呈现明显的家庭聚集性。

多联抗生素疗法治疗幽门螺旋杆菌（Hp）感染性胃病面临着Hp耐药性、副作用和治疗后再感染等问题，因此研制治疗性Hp疫苗是一项重要而紧迫的课题。

本项目依据机体对Hp的免疫保护性机制和表位疫苗的构建理论，合理选择Hp多种关键毒力因子和黏附因子（UreA、UreB、HpaA、CagA、CagL、KatA、NAP、Lpp20、HSP60）的B和Th优势抗原表位，利用多表位疫苗的设计理论和生物信息学软件，对抗原表位肽连接顺序、间隔序列和表位拷贝数以及分子内佐剂CTB或NAP的偶联顺序，加以分析和确定，构建了多种具有科学合理结构、可激发针对Hp关键黏附因子和毒力因子的、高特异性的抗体体液免疫应答和混合型细胞免疫应答的治疗性多表位疫苗（CTB-UE、CWAE、CFAdE、FVpE。

对上述治疗性多表位疫苗的研究实验结果如下。

（1）通过生物信息学软件MOE、DNAstar和RANKPEP等分析，所设计治疗性多表位疫苗均具有较好的等电点、抗原性和高级结构。

（2）利用基因合成、双酶切和PCR等分子克隆技术构建相应的重组表达载体，并将其转入BL21（DE3）或Arctic Express大肠杆菌中，经IPTG诱导可获得较高表达的目的蛋白;

采用Ni-NTA亲和层析和DEAE Sepharose FF阴离子交换层析获得了较高纯度的目的蛋白CTB-UE、CWAE、CFAdE和FVpE，纯度分别为96.8%、96.8%、95.2%、97.1%

（3）利用Hp多表位疫苗免疫BALB/c小鼠，采用Western blot、ELISA、Hp尿素酶活性抑制等实验证明：CTB-UE具有较好的免疫原性和免疫特异性，能够激发可识别Hp尿素酶A、B双亚基的高滴度表位特异性抗体和细胞免疫应答，且能有效抑制Hp尿素酶活性。

分子内佐剂CTB组分能够形成五聚体结构且与神经节苷脂GM1特异性结合，具有较好的免疫佐剂活性。

CWAE可激发机体产生针对Hp尿素酶A/B双亚基、黏附素HpaA、热休克蛋白HSP60和中性粒细胞激活蛋白NAP的高滴度表位特异性抗体和细胞免疫应答。

CFAdE能够激发BALB/c小鼠产生针对Hp尿素酶A/B双亚基、三种外膜蛋白（Lpp20、HpaA、CagL）的T细胞免疫应答和高滴度特异性抗体。

FVpE能够激发BALB/c小鼠产生针对Hp尿素酶A/B双亚基、CagA、VacA和NAP的T细胞免疫应答和高滴度特异性抗体

（4）通过构建Hp感染BALB/c小鼠或蒙古沙鼠模型，利用快速Hp尿素酶实验、组织病理性切片和Hp定量培养等多种实验方法证实： CTB-UE和CWAE能够显著降低小鼠胃部Hp尿素酶活性，减少定植于小鼠胃部的Hp，减轻小鼠胃部炎症，具有较为显著的治疗Hp感染效果

（5）利用流式细胞术、淋巴细胞增值实验和ELISA等实验表明：Hp关键抗原或所选择的Th细胞表位等刺激物能够特异性诱导CTB-UE或CWAE免疫小鼠的脾脏淋巴细胞发生增殖，流式细胞术表明CD4+ T细胞明显增殖;CTB-UE、CWAE能够激发机体产生高滴度IgG、IgA和黏膜分泌性IgA抗体（sIgA）以及IL-4、IFN-γ、IL-17等细胞因子。

本项目设计的Hp多表位疫苗，结构全新，其主要Hp多种关键毒力因子和黏附因子的B和Th优势抗原表位多拷贝体构成，创新性体现在以下3点。

（1）选择“可激发中和抗体的B细胞抗原表位和优势Th细胞抗原表位”来代替具有生物毒性的天然Hp大抗原，可避免Hp天然抗原的生物学毒性

（2）采取“偶联分子内免疫佐剂”和“抗原表位多重拷贝”两种设计思路来增强Hp关键毒力因子和黏附因子抗原表位肽的免疫原性，解决表位疫苗免疫原性普遍较低的缺陷。

（3）将Hp关键毒力因子和黏附因子二者结合起来，选择其优势Th和B细胞抗原表位，激发特异性细胞免疫应答和抗体体液免疫应答，以达有效防治Hp感染性疾病。

本项目针对治疗性Hp多表位疫苗的研究，有助于我国获得具有自主知识产权的治疗性Hp疫苗，社会经济效益前景可观。