一种快速高效的植物人工微RNA表达载体构建方法

随着越来越多的物种全基因组序列测定工作的完成，当前的基因组学研究热点已经由结构基因组学转向了功能基因组学。因此，发展能够快速、高效、高通量的基因功能研究方法和策略也自然成为了研究热点。

RNA干扰技术，因其特异性高、操作简便、重复性好，已成为当今动植物基因功能研究中重要的手段之一。然而，由于动植物细胞本身内在的特点，RNAi技术在动物基因功能研究中的应用已经相当广泛和普遍，而在植物中，由于脱靶效应的存在，其应用相对受阻。

近一年多来，陆续有文献报道植物人工微RNA（amiRNAs）能够高效、高特异性地沉默植物的内源和外源基因，且应用范围比传统的RNAi技术更加广泛。在美国的拟南芥2010计划中，就运用了植物amiRNAs表达技术研究拟南芥中以多基因家族形式存在的基因的功能。

本发明中构建植物amiRNAs表达载体的具体方法包括以下步骤： 1. 含amiRNAs表达单元的供体质粒的构建； 2. 引物设计； 3. PCR扩增； 4. 同源重组转化筛选。

由于在以amiRNAs供体骨架载体为模板的PCR过程中，miRNA 5’与3’侧翼序列之间的筛选标记基因或报告基因的表达单元（如：gfp、ccdB等）缺失，重组质粒和原始模板可以通过琼脂糖凝胶电泳有效区分；同时，还可以通过筛选标记基因或报告基因自身的特点，排除因模板污染而产生的背景。

5. 将人工微RNAs（amiRNAs）表达单元克隆到植物双元载体。

本发明与现有技术相比具有明显的优势： 一、整个过程不需要酶切连接反应，也不需要对载体或目的片段进行特殊处理，PCR产物就可直接转化大肠杆菌感受态细胞。 二、真正做到零背景的构建植物amiRNAs表达载体。 三、构建amiRNAs表达单元所用到的每条引物长度都可控制在60nt以内。 四、本发明采用接合辅助的遗传整合克隆（MAGIC）的方式将amiRNAs表达单元克隆到植物双元载体。 五、本发明的整个过程操作简单、成本低、效率高，很容易实现自动化和高通量操作。

该方法不仅适用于实验室小规模的单个基因功能研究，也适用于大规模的功能基因组学研究。

目前，已知的构建植物amiRNAs表达载体的方法主要有重叠延伸PCR法、引物导入法和直接合成法三种。以上方法虽然能够成功构建植物amiRNAs表达载体，但是仍然存在步骤繁琐、效率低下、成本高昂、使用范围狭窄等不足。

本发明提供了一种新的植物人工微RNA表达载体构建技术。该技术主要包括植物amiRNAs表达单元的构建和amiRNAs表达单元克隆到植物双元表达载体两大步骤。该技术不需订购长度大于60nt的引物，不需要对PCR产物及载体进行酶切、连接步骤就能迅速地构建植物amiRNAs表达载体，真正做到快速、高效、低成本地构建植物amiRNAs表达载体。

本发明涉及的是生物基因克隆表达技术，特别是一种快速高效构建植物人工微RNA表达载体的方法。特别适合用于大规模的构建针对植物的不同基因的植物人工微RNA表达单元，以研究植物基因的功能。在植物功能基因组学研究如火如荼的今天，该技术安全性好，应用前景广阔。

随着越来越多的物种全基因组序列测定工作的完成,当前的基因组学研究热点已经由结构基因组学转向了功能基因组学,从而发展能够快速、高效、高通量的基因功能研究方法和策略也自然成为了研究热点。RNA干扰技术由于特异性高,操作简便,重复性好,已成为当今动植物基因功能研究中重要的手段之一,然而由于动植物细胞本身内在的特点,RNAi技术在动物基因功能研究中的应用已经相当广泛和普遍,而在植物中,由于脱靶效应的存在导致其应用相对受阻。近一年多来,陆续有文献报导植物人工微RNA能够高效、高特异性地沉默植物的内源和外源基因,而且应用范围比传统的RNAi技术更加广泛。在美国的拟南芥2010计划中,就运用了植物amiRNAs表达技术研究拟南芥中以多基因家族形式存在的基因的功能。本发明中构建植物amiRNAs表达载体的具体方法为：1)含amiRNAs表达单元的供体质粒的构建;2)引物设计;3) PCR扩增。4)同源重组转化筛选。由于在以amiRNAs供体骨架载体为模板的PCR过程中,miRNA 5’与3’侧翼序列之间的筛选标记基因或报告基因的表达单元（如：gfp、ccdB等）缺失,重组质粒和原始模板可以通过琼脂糖凝胶电泳有效区分;还可以通过筛选标记基因或报告基因自身的特点,排除因模板污染而产生的背景;5)人工微RNAs （amiRNAs）表达单元克隆到植物双元载体.本发明与现有技术相比具有明显的优势：一、整个过程不需要酶切连接反应,也不需要对载体或目的片段进行特殊处理,PCR产物就可直接转化大肠杆菌感受态细胞。二、真正做到零背景的构建植物amiRNAs表达载体。三、构建amiRNAs表达单元所用到的每条引物长度都可控制在60nt以内。四、本发明采用接合辅助的遗传整合克隆（MAGIC）的方式将amiRNAs表达单元克隆到植物双元载体。 五、本发明的整个过程操作简单、成本低、效率高,很容易实现自动化和高通量操作。该方法不仅适用于实验室小规模的单个基因功能研究,也适用于大规模的功能基因组学研究。目前,已知的构建植物amiRNAs表达载体的方法主要有重叠延伸PCR法、引物导入法和直接合成法三种。以上方法虽然能够成功构建植物amiRNAs表达载体,但是仍然存在步骤繁琐、效率低下、成本高昂、使用范围狭窄等不足。本发明提供了一种新的植物人工微RNA表达载体构建技术。该技术主要包括植物amiRNAs表达单元的构建和amiRNAs表达单元克隆到植物双元表达载体两大步骤。该技术不需订购长度大于60nt的引物,不需要对PCR产物及载体进行酶切、连接步骤就能迅速地构建植物amiRNAs表达载体,真正做到快速、高效、低成本的构建植物amiRNAs表达载体。 本发明涉及的是生物基因克隆表达技术,特别是一种快速高效构建植物人工微RNA表达载体的方法。特别适合用于大规模的构建针对植物的不同基因的植物人工微RNA表达单元,以研究植物基因的功能。在植物功能基因组学研究如火如荼的今天,该技术安全性好,应用前景广阔。